Développement d'une immunothérapie par virus à ARN synthétique administrée par voie intraveineuse pour le traitement du cancer

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5907 (2022) Citer cet article

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L'efficacité thérapeutique des virus oncolytiques (VO) délivrés par voie intraveineuse est limitée par le développement de réponses d'anticorps neutralisants contre le virus. Pour contourner cette limitation et permettre une administration systémique répétée d'OV, nous développons ici des virus à ARN synthétiques constitués d'un génome d'ARN viral (ARNv) formulé dans des nanoparticules lipidiques. Pour deux candidats-médicaments à virus à ARN synthétique, le virus Seneca Valley (SVV) et le Coxsackievirus A21, nous démontrons la délivrance et la réplication de l'ARNv, l'assemblage du virus, la propagation et la lyse des cellules tumorales conduisant à une puissante efficacité anti-tumorale, même en présence d'anticorps neutralisants OV dans la circulation sanguine. La réplication du SVV synthétique dans les tumeurs favorise l'infiltration des cellules immunitaires, le remodelage du microenvironnement tumoral et améliore l'activité de l'inhibiteur de point de contrôle anti-PD-1. Chez la souris et les primates non humains, le SVV synthétique est bien toléré, atteignant une exposition bien supérieure à l'exigence d'une activité antitumorale. Au total, la plate-forme de virus à ARN synthétiques fournit une approche qui permet l'administration intraveineuse répétée d'immunothérapie virale.

Les virus oncolytiques (VO) sont une modalité thérapeutique intéressante contre le cancer qui tue sélectivement les cellules tumorales et enflamme le microenvironnement tumoral (TME). La combinaison des VO avec les immunothérapies anticancéreuses a le potentiel de favoriser le remodelage du TME et l'activation des cellules immunitaires, améliorant ainsi le bénéfice des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) dans les tumeurs peu ou non réactives. Jusqu'à présent, le bénéfice thérapeutique de la virothérapie oncolytique a été limité à une administration intratumorale nécessitant une réponse immunitaire antitumorale systémique pour être efficace contre les lésions non injectées. Le talimogène laherparepvec (Imlygic®)1 a démontré des réponses durables chez les patients atteints de mélanome lorsqu'il est administré par voie intratumorale, tout comme le Coxsackievirus A21 (CAVATAK®)2. L'administration intraveineuse (IV) d'OV peut améliorer l'efficacité en exposant tous les sites tumoraux, y compris les petites lésions métastatiques, aux OV. Cependant, le développement rapide d'anticorps neutralisants contre le virus après administration IV limite probablement l'exposition et l'infection des cellules tumorales après des doses répétées3,4.

Afin de maximiser le potentiel de l'immunothérapie virale, des stratégies pour éviter la neutralisation doivent être développées. Le reciblage5,6, les porteurs cellulaires7,8, le revêtement avec des polymères9,10,11 et des liposomes12,13 ont été utilisés pour protéger les OV des anticorps neutralisants, mais aucun n'a progressé jusqu'à la clinique. Les progrès de la nanotechnologie et leur utilisation pour délivrer des acides nucléiques ouvrent la voie à de nouveaux systèmes de transport pour surmonter les défis de l'administration intraveineuse d'OVs14,15.

Ici, nous décrivons le développement d'une plate-forme de livraison à base de nanoparticules qui permet l'administration IV répétée d'immunothérapies virales. Les modèles de plasmide sont conçus et optimisés pour la transcription in vitro (IVT) des génomes de virus à ARN (vRNA) qui, lors de la formulation dans des nanoparticules lipidiques (LNP), rendent les particules avec les propriétés biophysiques souhaitées pour soutenir l'administration intraveineuse répétée. Comme tous les composants sont synthétiques; nous appelons cette modalité virus à ARN synthétique.

Pour cette étude, nous avons sélectionné deux picornavirus, le virus Seneca Valley (SVV) et le Coxsackievirus A21 (CVA21), avec une activité oncolytique et une sécurité clinique bien documentées2,16,17,18,19. Leurs génomes sont des ARN simple brin de sens positif et sont suffisants pour initier le cycle de vie viral après avoir été introduits dans une cellule tumorale permissive. Cette étude rapporte la livraison d'ARNv et la réplication de Synthetic-SVV et Synthetic-CVA21. Nous montrons que les virus synthétiques sont bien tolérés et démontrent une production et une propagation virales sélectives pour les tumeurs dans plusieurs modèles de tumeurs, entraînant une oncolyse et une efficacité antitumorale. Nous prévoyons que cette plateforme thérapeutique répondra aux limites associées à l'administration intraveineuse répétée et améliorera le potentiel thérapeutique des VO.

Pour contourner les anticorps neutralisants qui inhibent l'activité des OV administrés par voie intraveineuse, nous avons développé des virus à ARN synthétiques pour l'administration systémique d'ARNv aux cellules tumorales. Une fois que l'ARNv/LNP est internalisé et libéré dans le cytoplasme d'une cellule tumorale, l'ARNv se réplique et génère une salve de virions infectieux qui se propagent localement, tuant les cellules tumorales adjacentes, ce qui favorise le recrutement de cellules immunitaires au TME (Fig. 1 ). Les constructions picornavirales d'ARNv SVV et CVA21 ont été validées in vitro et in vivo pour leur capacité à produire des virus (Figs. 1 et 2 supplémentaires). Nous avons ensuite optimisé une formulation de LNP pour l'administration IV avec les propriétés biophysiques souhaitées : petite taille (85 nm), monodisperse et efficacité d'encapsulation élevée (Fig. 3a supplémentaire).

Le virus à ARN synthétique est composé d'ARNv produit par IVT encapsulé dans un LNP. À l'intérieur des cellules tumorales, l'ARNv récapitule toutes les phases du cycle de vie viral de sorte qu'il se réplique et génère une salve de virions infectieux qui se propagent localement, infectent et tuent les cellules tumorales, recrutant ainsi des cellules immunitaires au TME.

Pour s'assurer que la réplication de l'ARNv est initiée après la traduction de la polyprotéine, les extrémités de l'ARNv de l'IVT doivent récapituler celles du génome viral à ARN. Ces extrémités sont générées pendant l'IVT par un ribozyme 5 'optimisé et une matrice de ruissellement produite par clivage par une enzyme de restriction de type IIS aux extrémités 3'. Pour améliorer la puissance de Synthetic-SVV, nous avons introduit des modifications dans le site d'entrée interne du ribosome (IRES)20 et une mutation dans VP2 qui améliore l'entrée virale21. Ces modifications ont amélioré son efficacité par rapport à l'ARNv22 du SVV-001 (Fig. 3b, c supplémentaires). À la fin de l'étude, la réplication du SVV a été détectée dans les cellules tumorales et non dans le tissu hépatique (Fig. 3d supplémentaire), indiquant que la distribution systémique de l'ARNv/LNP a conduit à la réplication virale dans les cellules tumorales permissives et non dans les tissus sains.

L'administration de SVV synthétique a entraîné une inhibition significative de la croissance tumorale (TGI) des xénogreffes de cancer du poumon à petites cellules (SCLC) NCI-H446 (Fig. 2a), y compris la régression de très grosses tumeurs (> 500 mm3, Fig. 4a supplémentaire) sans corps significatif perte de poids (Fig. 2b). L'administration de Synthetic-SVV-Neg (un ARNv incompétent pour la réplication) n'a pas inhibé la croissance tumorale (Fig. 2a), démontrant que le TGI est associé à la réplication du SVV. Trois jours après l'injection IV de virions synthétiques-SVV ou SVV en tant que contrôle positif, un signal d'hybridation fluorescente in situ (FISH) robuste dans la tumeur a été détecté à la fois dans les brins d'ARN de sens positif et négatif (Fig. 4b supplémentaire). La détection de l'ARN à brin négatif, une matrice pour le génome de l'ARN à brin positif du picornavirus, confirme sans équivoque la réplication de l'ARN viral. Dans les tumeurs de souris recevant du SVV-Neg synthétique non répliquant, seuls de faibles niveaux d'ARN à brin positif ont été détectés, probablement associés à de l'ARNv / LNP résiduel dans les vaisseaux sanguins (Fig. 4b supplémentaire).

a–d Souris nude athymiques implantées par voie sous-cutanée avec des tumeurs de xénogreffe SCLC NCI-H446. a, b Les souris ont été traitées par voie intraveineuse avec un véhicule témoin (PBS), Synthetic-SVV-Neg ou Synthetic-SVV les jours 1, 8 et 15, à 1,0 mg/kg (n = 8 par groupe). a Le volume de la tumeur (mm3) et b les changements de poids corporel (%) ont été surveillés. La croissance tumorale (mm3) et les changements de poids corporel (%) ont été surveillés. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sem La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un modèle linéaire mixte ***p < 0,001 vs PBS et ^^^p < 0,001 vs Synthetic-SVV-Neg. c, d Réplication du SVV synthétique dans les tumeurs NCI-H446 après une dose IV unique de 0,1 mg/kg de SVV. c Les niveaux d'ARN à brin négatif du SVV ont été déterminés par RT-qPCR (n = 5 par point dans le temps). Les particules d'infections SVV (PFU) ont été déterminées par dosage sur plaque. n = 3 échantillons de tumeur indépendants ont été évalués par point de temps. d FISH spécifiques aux brins d'ARN positifs (rouges) et négatifs (blancs) du SVV sont présentés pour les coupes tumorales NCI-H466. Les noyaux ont été marqués au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Ces images sont représentatives de quatre échantillons indépendants. L'échelle du panneau est indiquée sous l'image. e, f Des souris nude athymiques (n = 7 par groupe) implantées par voie sous-cutanée avec des tumeurs de mélanome humain SK-MEL-28 ont été traitées par administration intraveineuse avec soit un véhicule témoin (PBS) soit Synthetic-CVA21 les jours 1 et 8 à 2 doses différentes, 0,2 mg/kg ou 0,05 mg/kg. e La croissance tumorale (mm3) et f les changements de poids corporel (%) ont été surveillés. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sem La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un modèle linéaire mixte ***p < 0,001 vs PBS. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour explorer la relation dose-réponse après l'administration IV de Synthetic-SVV, nous avons effectué une titration de la dose. Un TGI puissant de tumeurs de xénogreffe NCI-H466 a été observé à tous les niveaux de dose, avec un TGI maximal atteint avec 0, 1 mg / kg ou plus (Fig. 4c supplémentaire). Une dose de 0,1 mg/kg a donc été choisie pour caractériser la cinétique de réplication virale. Après une seule administration IV de Synthetic-SVV, les tumeurs ont été récoltées à plusieurs moments et analysées par RT-qPCR et FISH. L'ARN viral à brin négatif et les virions intratumoraux ont été détectés dès 3 jours et ont atteint un plateau dans la plupart des tumeurs 7 jours après le traitement. Remarquablement, une réplication soutenue du SVV a été détectée jusqu'à 21 jours après l'administration d'une seule faible dose de Synthetic-SVV (Fig. 2c). Ces résultats ont été largement récapitulés avec la détection FISH des brins d'ARN positifs et négatifs du SVV, le signal FISH étant largement distribué dans la tumeur et culminant au jour 10 (Fig. 2d).

Le CVA21 a été sélectionné comme deuxième virus à ARN synthétique candidat, sur la base de ses propriétés oncolytiques, de sa tolérance IV favorable chez les patients cancéreux2,23,24 et de son tropisme tumoral distinct par rapport au SVV16,24. L'ARNv transcrit CVA21 IVT formulé avec la même composition lipidique que celle utilisée pour le SVV synthétique a produit des nanoparticules avec des propriétés biophysiques tout aussi souhaitables. Une régression complète de la tumeur à de faibles doses a été observée dans le modèle de mélanome SK-MEL-28 (Fig. 2e), sans perte de poids corporel significative (Fig. 2f).

La tolérance du virus Synthetic-SVV a été évaluée chez des souris immunocompétentes A/J permissives à l'infection par le SVV22. L'administration intraveineuse de Synthetic-SVV à 3 mg/kg a été bien tolérée lorsqu'elle a été administrée à des souris A/J portant une tumeur de neuroblastome syngénique, N1E-11525. Aucune modification indésirable significative du poids corporel, aucun signe clinique ou résultat histopathologique (Fig. 5a supplémentaire) n'a été observé. La quantification de l'OC par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) a montré une large distribution de la LNP dans tous les tissus analysés 30 minutes après la dose (Fig. 5b supplémentaire), suivie d'une clairance rapide, comme en témoigne l'absence de détection de l'OC à 24 heures. Il n'y a eu aucun changement dans la chimie clinique, y compris la fonction hépatique (Fig. 5c – e supplémentaire). Une élévation transitoire des cytokines pro-inflammatoires a été observée (Fig. 5f – j supplémentaires), comme indiqué pour d'autres LNP administrés par voie systémique26, mais elle n'a pas été accompagnée d'une activation du complément (Fig. 5k supplémentaire). Chez les souris naïves A / J, le SVV synthétique a montré une réplication virale minimale et transitoire dans les poumons, la rate et le foie (Fig. 5l supplémentaire).

Le CVA21 synthétique a également été bien toléré chez une souris transgénique exprimant le gène humain ICAM1 (huICAM1), le récepteur cellulaire du CVA21, et connue pour être sensible à l'infection par le CVA2127,28. L'administration IV de Synthetic-CVA21 n'a entraîné aucun signe clinique indésirable (Fig. 6a supplémentaire). Les résultats d'histopathologie se limitaient à de légers changements microscopiques dans le foie, attribués principalement au traitement avec la formulation de LNP. De faibles niveaux de réplication de CVA21 ont été détectés par RT-qPCR et par dosage du titre sur plaque dans la rate, le foie, les poumons, le cœur et les reins 2 jours après l'administration. Cependant, l'ARN à brin négatif ou les virions CVA21 étaient indétectables à 7 jours (Fig. 6b, c supplémentaires), indiquant que les souris avaient éliminé l'infection par CVA21. Ces données suggèrent que Synthetic-SVV et -CVA21 sont bien tolérés dans les modèles de souris connus pour être permissifs à ces virus à des doses supérieures à celles nécessaires pour provoquer une régression tumorale.

La tolérabilité de Synthetic-SVV a été évaluée plus en détail chez des primates non humains (NHP) ayant reçu trois fois toutes les deux semaines 1 mg/kg de Synthetic-SVV. Aucun signe clinique, des effets significatifs sur le poids corporel n'ont été observés (Fig. 7a supplémentaire). L'analyse pharmacocinétique du composant lipidique de la LNP a indiqué que l'exposition (AUC0-∞) atteinte dans le plasma NHP était 85 fois supérieure à l'exposition obtenue chez les souris nues athymiques dosées avec le niveau de dose le plus efficace dans le modèle SCLC NCI-H446 (Fig. 4a et 4a supplémentaires). Tableau 1). L'administration systémique de Synthetic-SVV a distribué l'ARNv à tous les tissus examinés, y compris la rate, le foie, les reins, les muscles, les poumons et le cerveau, 24 h après la troisième dose (Fig. 7b supplémentaire), reflétant la large biodistribution du lipide LNP. composant observé chez la souris porteuse de tumeur (Fig. 5b supplémentaire).

De plus, aucun résultat histologique n'a été observé chez les NHP. Seule une élévation mineure et transitoire des paramètres chimiques du foie a été observée (Fig. 7c – e supplémentaire). Les cytokines pro-inflammatoires plasmatiques, y compris l'IL-6 et la MCP-1, et l'activité du complément ont augmenté de manière transitoire dans les 2 à 24 h suivant l'administration intraveineuse (Fig. 7f – h supplémentaire). Ces résultats démontrent la tolérabilité d'une dose répétée de Synthetic-SVV chez les singes cynomolgus à un niveau de dose qui dépasse les expositions nécessaires pour déclencher une activité antitumorale puissante.

Nous avons postulé que la livraison d'ARNv/LNP serait résistante aux anticorps neutralisant le virus en circulation. Pour tester cette hypothèse, nous avons immunisé passivement des souris immunodéficientes portant le NCI-H466 avec soit un sérum de lapin témoin, soit un sérum de lapin anti-SVV avec un pouvoir de neutralisation confirmé pour le SVV-001, le SVV(S177A) et le SVV(S177A-IRES2 ) virus, ces derniers étant codés par l'ARNv dans Synthetic-SVV (Fig. 8a – c supplémentaires). Nous avons ensuite comparé l'efficacité anti-tumorale de 0, 1 mg / kg de virions SVV synthétiques ou SVV (S177A-IRES2) (Fig. 3). Les animaux témoins traités au sérum et dosés au SVV(S177A-IRES2) ou au Synthetic-SVV ont présenté une puissante activité antitumorale par rapport au véhicule témoin. En revanche, chez les souris prétraitées avec du sérum anti-SVV, l'efficacité du SVV administré par voie intraveineuse (S177A-IRES2) a été complètement abrogée, tandis que le SVV synthétique est resté puissant pour inhiber la croissance des xénogreffes NCI-H466. Une abrogation similaire de l'activité du SVV-001 évalué cliniquement a été observée en présence d'anticorps neutralisants tandis que le SVV synthétique est resté actif (Fig. 8d supplémentaire)

L'efficacité anti-tumorale du virus SVV dérivé du SVV synthétique (S177A-IRES2) et du SVV synthétique telle qu'évaluée par le volume tumoral (mm3) a été évaluée chez des souris porteuses de tumeur NCI-H446 après injection de sérum de lapin anti-SVV témoin ou neutralisant. Les souris qui ont été immunisées passivement avec des antisérums SVV ont reçu 3 injections IV de 106 PFU de virions SVV (S177A-IRES2) ou de 0, 1 mg / kg de SVV synthétique (n = 10 par groupe). Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SEM. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un modèle linéaire mixte. p < 0,001 vs PBS, SVV(S177A-IRES2) & Control Ab. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons ensuite cherché à évaluer l'activité de Synthetic-SVV dans des modèles qui pourraient être plus représentatifs du SCLC humain que les modèles de xénogreffe sous-cutanée. Le SCLC est une indication appropriée pour le développement clinique du SVV synthétique, étant donné que le SVV a un tropisme établi pour les tumeurs d'origine neuroendocrinienne16,22. Chez des souris portant des tumeurs NCI-H82 implantées orthotopiquement dans le poumon, deux administrations IV de SVV synthétique ont déclenché la réplication du SVV (Fig. 9a supplémentaire) et ont presque doublé la survie par rapport aux bras témoins (Fig. 4a). L'immunohistochimie (IHC) pour le ligand humain de type Delta 3 (hDLL3), un marqueur neuroendocrinien hautement exprimé dans les cellules NCI-H82 (Fig. 9b supplémentaire), a été utilisée pour quantifier la charge tumorale. L'évaluation des tissus prélevés 10 jours après le traitement a révélé une réduction significative de la charge tumorale et une nécrose tumorale centrale étendue dans les poumons des souris traitées avec le SVV synthétique (Fig. 4b, c).

a–c Des tumeurs NCI-H82 ont été implantées orthotopiquement chez des souris nude athymiques. Les animaux ont reçu soit du PBS, soit 1,0 mg/kg de SVV synthétique-Neg, soit 1,0 mg/kg de SVV synthétique aux jours 15 et 22 après l'inoculation de la tumeur (n = 15 par groupe). a L'analyse de survie a été évaluée à l'aide du test du log-rank (Mantel-Cox), ***p = 0,003 ; ****p < 0,0001 vs SVV synthétique. b Analyse morphométrique de la zone positive pour hDLL3 du tissu pulmonaire et extrapulmonaire occupée par une tumeur viable dans les poumons prélevés sur des souris 10 jours après le traitement. La signification statistique a été déterminée à l'aide du test T apparié bilatéral, *p = 0,011 ; ***p = 0,0003. c Images représentatives de la coloration HDLL3 telle que déterminée dans 15 échantillons individuels/bras de traitement. Les barres d'échelle en haut à gauche sont de 1000 µm. d Des souris NOD / SCID ont été implantées par voie sous-cutanée avec des tumeurs SCLC PDX (Crown Bioscience, San Diego, CA) et dosées par administration IV avec soit un véhicule témoin (PBS), Synthetic-SVV-Neg ou Synthetic-SVV 1 mg / kg les jours 1 et 8 (n = 8 par groupe). Le volume de la tumeur (mm3) a été surveillé à différents moments. e Des souris RPM ont été implantées par voie sous-cutanée avec des cellules de culture primaire SCLC GEMM et dosées par administration IV avec soit un véhicule témoin (PBS), Synthetic-SVV-Neg ou Synthetic-SVV 1 mg/kg les jours 1 et 8 (n = 8 par groupe ). Le volume de la tumeur (mm3) a été surveillé à différents moments. d, e Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SD. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un modèle linéaire mixte, ***p < 0,001 vs PBS et ^^p < 0,01 ; ^^^p < 0,001 vs Synthétique-SVV-Neg. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

On pense que les xénogreffes dérivées de patients (PDX) et les modèles de souris génétiquement modifiées (GEMM) représentent mieux l'hétérogénéité et l'altération génétique des cancers humains29. Étant donné que SCLC est connu pour son hétérogénéité conduisant à l'émergence de maladies résistantes au traitement et à la récidive30,31,32, nous avons évalué la capacité de Synthetic-SVV à se répliquer dans un modèle SCLC PDX. Des souris portant un modèle SCLC-PDX ont reçu une dose intraveineuse de SVV synthétique, de SVV synthétique-Neg ou de véhicule et par voie intratumorale de virions SVV-001 comme témoin positif. Des niveaux similaires de réplication virale ont été observés lorsque Synthetic-SVV a été administré par voie systémique, ou lorsque des virions SVV-001 ont été administrés par voie intratumorale (Fig. 9c supplémentaire). De plus, une puissante activité anti-tumorale a été observée après l'administration de Synthetic-SVV (Fig. 4d).

Les tumeurs issues des GEMM imitent étroitement les caractéristiques moléculaires, l'hétérogénéité tumorale et l'histopathologie de leurs homologues humains. Nous avons évalué l'efficacité de Synthetic-SVV dans un modèle SCLC GEMM transplantable33 (Rb1fl/flTrp53 fl/flMyc LSL/LSL) avec des profils histopathologiques et transcriptionnels similaires au SCLC humain. Le SVV synthétique a inhibé de manière significative la croissance tumorale (Fig. 4e). Les tumeurs collectées 5 jours après l'administration ont démontré un niveau élevé de réplication du SVV (Fig. 9d supplémentaire). De plus, nous avons profilé les changements dans le microenvironnement immunitaire dans ce modèle par Nanostring PanCancer IO 360™ Panel. Nous avons observé une augmentation notable des scores associés à la cytotoxicité, à la signalisation de l'interféron et aux voies du compartiment lymphoïde dans les tumeurs des souris traitées avec le SVV synthétique par rapport au contrôle du véhicule (Fig. 9e supplémentaire), indiquant que la réplication in situ du SVV a conduit à un TME plus enflammé.

La modification du TME induite par Synthetic-SVV a été caractérisée dans la tumeur syngénique N1E-115, un modèle mal infiltré par les cellules immunitaires (Fig. 10 supplémentaire). L'administration de Synthetic-SVV a entraîné une augmentation significative du recrutement de lymphocytes T CD8 et une tendance pour les lymphocytes T CD4 et les cellules NK (Fig. 5a et Fig. 11a supplémentaire). Le nombre de cellules T régulatrices (Treg) n'a pas augmenté dans les tumeurs, entraînant un rapport CD8/Treg élevé qui a été associé à un bénéfice clinique amélioré avec la thérapie anti-PD-134 (Fig. 5b). Les cellules T CD8 ont montré un phénotype activé, avec CTLA4 et PD-1 régulés positivement (Fig. 5c). Les cellules effectrices à courte durée de vie (SLEC, CD8 +, CD127, KLRG1 +) et les cellules effectrices précurseurs de la mémoire (MPEC, CD8 +, CD127 +, KLRG1−) ont été augmentées avec le SVV synthétique par rapport au contrôle (Fig. 5d). Les macrophages associés aux tumeurs ont également été profilés et une augmentation du rapport M1 (phagocytaire, CD206-CD86 +) / M2 (pro-inflammatoire, CD206 + CD86-) a été observée (Fig. 5e et Fig. 11b supplémentaire). Le nombre de macrophages M1 (Fig. 5f) et de cellules tumorales exprimant le ligand PD-1 (PD-L1) a également augmenté de manière significative (Fig. 5g). Des résultats concordants ont été obtenus lorsque les tumeurs ont été analysées par le panel NanoString PanCancer IO 360™ (Données supplémentaires 1). Le traitement au SVV synthétique a augmenté de manière significative les voies associées au recrutement et à l'activation des cellules immunitaires (Fig. 12 supplémentaire). Ces données indiquent que Synthetic-SVV favorise le recrutement des cellules immunitaires et l'immunité antitumorale. De plus, deux doses hebdomadaires de Synthetic-SVV ont entraîné un TGI important (Fig. 13 supplémentaire).

a–g Souris A/J (n = 5 par groupe) implantées par voie sous-cutanée avec des tumeurs neuroendocrines syngéniques N1E-115. Les souris ont été traitées par administration IV avec soit un témoin de véhicule PBS, soit 1 mg/kg de SVV synthétique les jours 1 et 8. Les tumeurs ont été recueillies 6 jours après la deuxième dose. a Nombre de cellules NK, NKT, CD4, CD8 et Treg par mg de tumeur. Pour CD8 p = 0,0002 avec un test ANOVA bidirectionnel b Rapport CD8/Treg. c Nombre de lymphocytes T CD8 par mg de tumeur qui expriment CTLA-4 ou PD-1. Pour PD1 p = 0,01 avec un test ANOVA à deux voies. d Nombre de lymphocytes T CD8 par mg de tumeur qui sont SLEC (CD127-KLRG1+) ou MPEC (CD127+-KLRG1−). e Rapport des macrophages M1/M2. p = 0,0002 avec un test T bilatéral d'étudiants appariés. f Nombre de macrophages M1 et M2 PD-L1+ par mg de tumeur. p = 0,01 avec un test T bilatéral d'étudiants appariés. g Nombre de cellules CD45- PD-L1+ par mg de tumeur. p = 0,01 avec un test T bilatéral d'étudiants appariés. h Des souris A / J (n = 10 par groupe) ont été implantées par voie sous-cutanée avec des tumeurs N1E-115 et traitées par administration IV avec soit Synthetic-SVV les jours 1 et 8 (0,3 mg / kg), et un anticorps de contrôle d'administration IP (souris IgG2a ) ou un anticorps anti-PD-1 aux jours 1, 4 et 7 (200 µg) comme indiqué. Le volume de la tumeur (mm3) a été surveillé. Les données sont rapportées sous forme de moyenne ± sem La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un modèle linéaire mixte a été appliqué, *p = 0,01vs. IgG2a, *p = 0,03 vs Synthétique-SVV/IgG2a. h Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'augmentation de l'inflammation dans le TME et la régulation à la hausse de PD-L1 sur les cellules tumorales N1E-115 et les macrophages associés aux tumeurs ont fourni une justification solide pour combiner le SVV synthétique avec un antagoniste de PD-1. Étonnamment pour ce modèle de tumeur froide, l'anticorps anti-PD-1 a produit un TGI modeste mais significatif, similaire à une dose sous-optimale de Synthetic-SVV ; cependant, leur combinaison a fourni une efficacité significativement supérieure à celle de chaque agent unique (Fig. 5h).

Ce rapport décrit la conception et le développement de virus à ARN synthétiques pour le traitement systémique du cancer. L'administration intraveineuse des génomes d'ARNv pour deux picornavirus, SVV et CVA21, formulés dans des LNP, a été bien tolérée et a provoqué la production in situ spécifique à la tumeur d'OV, le recrutement de cellules immunitaires et, finalement, la destruction de la tumeur. L'efficacité a été observée dans plusieurs modèles de cancer, y compris les xénogreffes, PDX, GEMM et les modèles syngéniques. De plus, un bénéfice de survie a été observé dans un modèle de tumeur SCLC orthotopique. Le SVV synthétique est resté efficace même en présence d'anticorps neutralisants spécifiques du virus circulant et a été encore renforcé par la combinaison avec un inhibiteur du point de contrôle immunitaire PD-1.

Les VO au stade clinique, y compris ceux qui n'ont pas ou peu été exposés auparavant chez l'homme, comme le SVV, le CVA21 ou l'énadenotucirev, un adénovirus d'origine non naturelle, ont signalé une neutralisation après des doses intraveineuses répétées, limitant probablement la fenêtre d'efficacité à une courte période16, 17,23,35,36. Nous avons montré ici que, contrairement à l'activité in vivo des virions SVV, l'activité de Synthetic-SVV restait puissante même en présence d'anticorps neutralisant le SVV. Bien que les deux traitements utilisent le même génome viral, il est important de reconnaître que la modalité du virus synthétique diffère considérablement de son parent picornaviral en ce qui concerne la stabilité, la biodistribution, l'échappement endosomal et le tropisme d'entrée initial ; et pourtant la dose de Synthetic-SVV délivrée à la tumeur était encore suffisante pour provoquer une forte efficacité antitumorale en présence d'antisérums neutralisants. Nous émettons l'hypothèse qu'une fois le génome viral délivré et la réplication initiée dans les cellules tumorales permissives, la concentration d'anticorps dans le milieu tumoral interstitiel n'atteint pas le seuil requis pour inhiber la propagation de cellule à cellule pendant l'infection virale. Ces données sont en accord avec l'absence d'impact de la pré-immunisation sur l'activité préclinique et clinique du VHS oncolytique après injection intratumorale1,37. Par conséquent, notre stratégie devrait surmonter le défi central dans le domaine des OV en permettant une administration intraveineuse répétée, offrant ainsi la possibilité à toutes les lésions tumorales chez un patient d'être exposées à l'agent thérapeutique tout en évitant la neutralisation. Enfin, nous nous attendons à ce que l'administration systémique de virus à ARN synthétiques profite aux patients atteints d'une maladie disséminée et aux patients pour lesquels il est difficile d'effectuer des injections OV intralésionnelles répétées en toute sécurité. Le traitement du cancer du poumon est particulièrement intéressant à cet égard car les deux virus à ARN synthétiques que nous décrivons ici, SVV et CVA21, ont un tropisme pour SCLC et NSCLC, respectivement.

SVV a un tropisme connu pour SCLC17,22, et cela est confirmé par nos données montrant une activité anti-tumorale dans plusieurs modèles SCLC. Le tropisme tumoral CVA21 est piloté par l'expression de son récepteur d'entrée ICAM1, qui est fortement exprimé dans le NSCLC et d'autres indications tumorales38,39. En plus de son récepteur d'entrée, le tropisme viral est également limité après l'entrée par l'IFN de type I et les facteurs de restriction virale dans la cellule infectée. Celles-ci sont essentielles à prendre en compte dans le contexte de la plate-forme de livraison de virus à ARN synthétique, car elle utilise le LNP pour contourner initialement le récepteur d'entrée viral. Alors que l'administration IV de virus à ARN synthétique a conduit à une large distribution tissulaire, une détection minimale et transitoire de la réplication du SVV ou du CVA21 a été observée dans les tissus normaux de souches de souris sensibles. Ces résultats démontrent une réplication et une élimination sélectives de la tumeur par la réponse antivirale de l'hôte dans les tissus normaux. Dans l'ensemble, les virus à ARN synthétiques ont été bien tolérés après une ou plusieurs doses IV chez des souris et des primates non humains, tout comme les formulations d'ARNm/LNP codant pour des protéines thérapeutiques décrites par d'autres dans des études précliniques40 et cliniques41.

Le mode d'action des VO implique la destruction directe des cellules cancéreuses et la stimulation de l'immunité anti-tumorale42. Le traitement du SCLC et du NSCLC pourrait particulièrement bénéficier de l'administration répétée d'OV par IV, comme le permet la plate-forme de virus à ARN synthétique, car les injections intralésionnelles sûres sont difficiles dans le cancer du poumon. Le SCLC et le NSCLC sont connus pour leur charge mutationnelle tumorale élevée43,44, pour leur sensibilité aux inhibiteurs de point de contrôle immunitaire et pour leur capacité à répliquer respectivement le SVV et le CVA21. Bien que la puissante activité anti-tumorale du virus à ARN synthétique dans des modèles de tumeurs humaines xénogreffés chez des souris immunodéprimées soit probablement due à la propagation sans contrainte de l'infection dans la tumeur et à l'oncolyse, l'infection peut probablement être limitée par des cellules immunitaires reconnaissant et éliminant les cellules infectées dans un hôte immunocompétent. La détection immunitaire de la réplication virale peut, à son tour, faciliter l'efficacité des virus à ARN synthétique en améliorant le recrutement et l'activation des cellules immunitaires. Comme observé pour d'autres OV37, le SVV synthétique a remodelé le TME et augmenté le nombre de lymphocytes T CD8 et de macrophages phagocytaires M1. La régulation à la hausse de PD-L1 sur les cellules tumorales et myéloïdes a justifié la combinaison du SVV synthétique avec l'anti-PD-1, démontrant un bénéfice thérapeutique amélioré au-dessus de chaque monothérapie. Le bénéfice des antagonistes PD-(L)1 actuellement approuvés pour le traitement du SCLC et du NSCLC est limité à un petit pourcentage de patients ; nos données suggèrent que leur association avec des virus à ARN synthétiques peut améliorer les résultats chez ces patients.

Les virus à ARN synthétiques représentent une modalité thérapeutique pour le traitement du cancer avec le potentiel de transformer le paradigme actuel d'injection intralésionnelle pour les OV en une administration IV répétée pratique. Cette modalité a le potentiel d'exposer toutes les lésions tumorales chez un patient à un médicament vivant puissamment oncolytique qui peut infecter et se propager dans les tumeurs tout en stimulant les réponses immunitaires anti-tumorales. Synthetic-SVV et Synthetic-CVA21 ont une activité puissante dans les modèles précliniques, même en présence d'anticorps neutralisants, et sont bien tolérés chez les rongeurs et les primates non humains. Ces données soutiennent la progression de Synthetic-SVV et -CVA21 vers des essais cliniques pour le traitement du cancer du poumon et d'autres indications tumorales permissives en monothérapie ou en association avec un régime de soins standard contenant des ICI.

Toutes les procédures expérimentales dans des modèles animaux, y compris les souris et les primates non humains, ont été examinées et approuvées par les comités institutionnels respectifs de protection et d'utilisation des animaux, ont suivi les directives des NIH comme spécifié dans le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, 8e édition. Les études sur les PSN ont été menées dans un établissement accrédité par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC).

Les RT-qPCR ont été collectées à l'aide du système de PCR en temps réel QuantStudio 6 Pro de ThermoFisher (Applied Biosystems). Les sections d'immunohistochimie (IHC) ont été numérisées à l'aide du Hamamatsu Nanozoomer, le cytomètre d'imagerie Spectra Max i3X minimax a été utilisé pour quantifier la florescence et la caractérisation des nanoparticules lipidiques (LNP) a été réalisée avec Zetasizer Nano ZS, BO LSRFortessa à l'aide du logiciel BO FACSDiva v8.0.3. Pour les tests d'immunofluorescence (IF), les images ont été acquises sur le scanner 30 Histec Panoramic 250. Pour NanoString, les échantillons ont été analysés à l'aide de l'analyseur numérique nCounter. La concentration en lipides OC a été déterminée par analyse LC-MS. Un système Waters Zevo TQs équipé d'un détecteur MRM a été utilisé pour l'étape chromatographique.

Microsoft Excel (Office 365), Graphpad Prism v9, FlowJo vl0.7.1 et 30 Histec Caseviewer 2.4 (CaseViewer- 3DHISTECH Ltd.) ont été utilisés pour analyser les lames FISH. QuPath a été utilisé pour évaluer DLL3 IHC. La collecte des données a été réalisée sur l'analyseur numérique nCounter (NanoString Technologies).

Lignées cellulaires NCI-H466 (HTB-171), NCI-H82 (HTB-175), NCI-H1299 (CRL-5803), SK-MEL-28 (HTB-72), CT26 (RL-2638), 4T1 (CRL -2539) et N1E-115 (CRL-2263) ont tous été achetés auprès de l'ATCC (Gaithersburg, MD). CT-2A-luc (SCC195) et MCC14/2 (10092303) ont été achetés chez Millipore Sigma (Burlington, MA). La lignée cellulaire d'adénocarcinome du côlon murin MC38 a été gracieusement offerte par le professeur Joseph Glorioso de l'Université de Pittsburgh. Les cultures de cellules NCI-H446, NCI-H82, NCI-H1299, SK-MEL-28, MCC14/2, CT26 et 4T1 ont toutes été maintenues dans du milieu RPMI-1640 (Gibco, Gaithersburg, MD) additionné de 10 % d'inactivation thermique. FBS (Gibco, Gaithersburg, MD) et pénicilline/streptomycine à 1 % (Gibco, Gaithersburg, MD). Les cellules MC38, CT-2A-luc et N1E-115 ont été cultivées dans du milieu DMEM (Gibco, Gaithersburg, MD) additionné de 10 % de FBS inactivé par la chaleur et de 1 % de pénicilline/streptomycine. Toutes les cultures cellulaires ont été incubées dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 °C.

Des séquences picornavirales à brin positif ont été obtenues auprès de NCBI (SVV-00145 (GenBank : DQ641257) et CVA2146 (Genbank : AF546702.1). Des ribozymes personnalisés ont été conçus pour le 5 'de la matrice virale et des séquences de poly adénosine (pA) de 30 nucléotides. ont été ajoutés à l'extrémité 3', suivis du site de restriction SapI (SVV) ou BsmBI (CVA21) pour générer des matrices de polythymidine de la longueur appropriée après linéarisation La mutation SVV-S177A a été introduite par mutagenèse ponctuelle pour le virus SVV-S177A utilisé dans la figure supplémentaire 8, et le virus SVV synthétique, SVV (S177A-IRES2) comprend SVV-001, y compris cette mutation et un IRES amélioré, SVV IRES2 Cette séquence est dérivée de SVA/Canada/MB/NCFAD-104-1 /2015 (GenBank : KY486156). Les modèles IVT ont été construits avec des fragments d'ADNdb synthétiques (IDT Geneblocks, Genscript, Piscataway, NJ) et l'assemblage Gibson (NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix, Catalog #E2621L, NEB, Ipswich, MA) suivant le protocole du fabricant Ces constructions ont été séquencées bout à bout, linéarisées avec SapI (SVV) ou BsmBI (CVA21) (NEB SapI # R0569L, BsmBI # R0739L, Ipswich, MA) et des IVT de qualité recherche (NEB HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit Catalog #E2040S, Ipswich, MA) ont été réalisées pour assurer le lancement viral. Tous les stocks viraux utilisés dans ce travail ont été obtenus avec ces systèmes de génétique inverse.

Des IVT à grande échelle (20-100 mg) ont été réalisées à Aldevron (Fargo, ND) et purifiées par diafiltration. Dans certains cas, des IVT (1 à 50 ml) ont été réalisées en interne à l'aide d'un bloc chauffant (Eppendorf Thermomixer, Hambourg, Allemagne) à 37 ° C pendant 2,5 h à l'aide d'un tampon contenant de l'acétate de magnésium, du Tris-HCl (EMD-Millipore, Danvers, MA), TCEP (EMD Millipore Danvers, MA), NTP équimolaires (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), pyrophosphatase inorganique (NEB Ipswich, MA) et T7 RNAP (NEB, Ipswich, MA). De la DNase I (NEB, Ipswich, MA) a été ajoutée à la fin de l'IVT pendant 30 min et désactivée avec de l'EDTA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Ensuite, une filtration à flux tangentiel (TFF) a été réalisée à l'aide d'une membrane mPES de 100 kDa (Repligen, Marlborough, MA) et diafiltrée à l'aide d'eau. Le rétentat de TFF a ensuite été ajusté en sel et chargé sur une colonne de chromatographie Oligo-dT (BIA Separations, Ajdovščina, Slovénie). L'ARN contenant une queue pA a été élué avec de l'eau. Une étape finale de TFF a été réalisée en tant qu'étape de dessalage pour garantir que la concentration d'ARN souhaitée (1,0 mg/mL) et le pH (6,5) ont été atteints. Ces ARN ont servi de base à la génération de LNP.

Les LNP ont été préparés en mélangeant des volumes appropriés de lipides dans de l'éthanol avec une phase aqueuse contenant de l'ARNv à l'aide d'un dispositif microfluidique NanoAssemblr (Precision NanoSystems), suivi d'un traitement en aval. En utilisant un rapport de débit de 3:1 phase aqueuse : phase organique, les solutions ont été combinées à l'aide d'une puce microfluidique et d'un débit total de 12 mL/min. Les LNP ont été dialysés contre un tampon à pH neutre tel que du PBS 1 × pour éliminer l'éthanol et augmenter le pH. Les LNP résultants ont été concentrés à l'aide d'unités de filtre centrifuge Amicon Ultra avec un seuil de poids moléculaire de 100 000 Da (Millipore, Burlington, MA). L'encapsulation d'ARN a été dosée à l'aide de Quant-iT RiboGreen (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) et d'un lecteur de microplaques (SpectraMax, San Jose, CA). La taille hydrodynamique et le PDI des LNP ont été analysés par diffusion dynamique de la lumière à l'aide d'un Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical, Malvern, Royaume-Uni).

La production de stock viral a été réalisée par transfection d'ARNv à l'aide de Lipofectamine RNAiMax® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Le réactif de transfection (1 μg/ml) a été ajouté aux cellules NCI-H1299 ensemencées dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits à raison de 1 × 105 cellules/puits. Après 72 h post-transfection, les surnageants ont été collectés, centrifugés à 2000 × g pendant 5 minutes et filtrés à travers un filtre de 0,45 μm. Le surnageant filtré (100 μl) a été utilisé pour infecter une nouvelle plaque 12 puits ensemencée avec des cellules NCI-H1299. Après 72 h, les cellules et les surnageants ont été soumis à 3 cycles de congélation-décongélation, puis centrifugés et filtrés. Le surnageant (1 ml) a ensuite été utilisé pour infecter des cellules NCI-H1299 cultivées à 80 % de confluence dans un récipient de culture tissulaire CellSTACK® (Corning, Corning, NY) à deux chambres dans 250 ml de milieu de croissance. Après 96 h après l'infection, les cellules et les surnageants ont été congelés-décongelés 3 fois, centrifugés, filtrés et concentrés à l'aide d'unités de filtration centrifuge Amicon® Ultra 15 100K (Millipore, Burlington, MA) jusqu'à un volume final de 10 ml qui a été aliquoté et conservé à -80 °C.

Pour quantifier l'infectivité du SVV par IC50, des cellules NCI-H446 ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits à 1 × 104 cellules/puits et incubées à 37 °C, 5 % de CO2. Après 48 h, le milieu de culture a été aspiré et remplacé par des dilutions en série de 10 fois de SVV infectieux dans un volume de 100 µL. Après 48 h, la viabilité cellulaire des cellules infectées ou traitées par simulation a été mesurée avec le test luminescent CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) à l'aide d'un lecteur de microplaques (Molecular Devices, cytomètre d'imagerie SpectraMax i3X minimax, San Jose, CA). Les données brutes ont été converties en pourcentage de survie par rapport aux pseudo-infectés. Les valeurs ont été représentées graphiquement dans le logiciel GraphPad Prism 9.0 et analysées à l'aide d'un graphique sigmoïde non linéaire à pente variable (régression linéaire asymétrique à quatre points) pour générer des valeurs IC50. Au moins cinq répétitions techniques ont été analysées pour chaque échantillon afin de calculer la CI50.

Pour quantifier le titre de SVV par essai sur plaque, 2 × 105 cellules MCC14/2/puits ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire à 12 puits. Après 24 h, le virus infectieux a été dilué 10 fois en série dans un milieu sans sérum. Le milieu de culture des cellules a été aspiré et remplacé par 300 µL/puits de virus dilué pendant une période d'adsorption de 1 h à 37 °C avec une légère oscillation. Les échantillons de virus ont été analysés en triple exemplaire technique. Après l'adsorption, 2 ml de méthylcellulose à 1 % préchauffée dans un milieu avec 5 % de FBS ont été ajoutés à chaque puits. Après 48 h, les puits ont été aspirés et colorés avec une solution de cristal violet. Les colonies discrètes formant des plaques ont été comptées manuellement pour déterminer le titre.

Pour quantifier le virus CVA21 par essai sur plaque, 2 × 105 cellules SK-MEL28/puits ont été ensemencées dans une plaque à 24 puits (ou 2,5 × 105 cellules NCI-H1299/puits dans une plaque à 12 puits). Des homogénats de tissus de souris ont été produits en remettant en suspension des échantillons de tissus congelés pulvérisés dans 2 ul de PBS/mg de tumeur. Après mélange, les échantillons ont été culottés et les surnageants ont été récupérés. Les homogénats de tissus entiers ont été dilués en série 10 fois dans un milieu sans sérum. Une fois le milieu retiré, 250 μl des dilutions ont été ajoutés à chaque puits. La plaque a été doucement secouée à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, 1 ml de méthylcellulose à 1 % préchauffée dans un milieu contenant du FBS à 5 % a été ajouté en superposition. Les plaques ont été incubées pendant 48 h avant d'ajouter 250 μl de colorant violet cristal dans chaque puits ; ensuite, le revêtement a été retiré et secoué à température ambiante pendant 30 min. Les plaques ont été lavées et laissées sécher pour visualiser les plaques.

Des antisérums polyclonaux de lapin SVV ont été générés contre le SVV inactivé par les UV aux Maine Biotechnology Services (Portland, ME). Pour mesurer le titre de neutralisation, les cellules NCI-H446 ont été ensemencées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits à 1 × 104 cellules/puits dans un milieu complet et incubées à 37 °C, 5 % de CO2. Après 48 h, 1 × 107 TCID50/mL de SVV ont été mélangés avec des sérums anti-SVV de lapin dilués dans du milieu complet. Des dilutions en série de deux fois des sérums de 1:20 à 1:5120 ont été testées. Le milieu de culture a été aspiré des cellules et remplacé par 100 ul de SVV dilué par puits. Les cellules ont été remises en incubation à 37 ° C, 5% de CO2 et des tests de viabilité in vitro ont été effectués 48 h après l'infection en ajoutant 100 µL / puits de réactif CellTiter-Glo® 2.0 (Promega, Madison, WI). La luminescence totale (RLU) a été mesurée sur un lecteur de plaque (Molecular Devices, cytomètre d'imagerie SpectraMax i3X minimax, San Jose, CA). Les données brutes ont été converties en pourcentage de survie par rapport aux pseudo-infectés, et les valeurs ont été représentées graphiquement dans GraphPad Software Prism 9.0.

Les cellules NCI-H82 ont été récoltées par détachement avec de la trypsine-EDTA (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts), lavées par centrifugation et remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée contenant 5% d'albumine de sérum bovin (BSA). Un million de cellules par mL ont été incubées avec 10 µg/mL d'anticorps conjugué à la phycoérythrine spécifique de DLL3 (Cat # 154003) ou d'isotype contrôle (Cat # 400607). Les deux anticorps ont été achetés auprès de BioLegend (San Diego, États-Unis) et les données ont été acquises sur un BD LSRFortessa à l'aide du logiciel BD FACSDiva et analysées à l'aide du logiciel FlowJo.

Des expériences in vivo dans des modèles tumoraux de xénogreffe NCI-H466, NCI-H82, NCI-H1299 et SK-MEL-28 ont été menées chez des souris femelles nues NU/NU âgées de 8 à 12 semaines (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) . Le modèle de tumeur de neuroblastome murin N1E-115 a été établi chez des souris femelles A/J âgées de 8 à 12 semaines (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Pour les études sur les modèles de tumeurs 4T1 et CT26, des souris BALB/c femelles âgées de 8 à 12 semaines (Charles River Laboratories) ont été utilisées. Des études utilisant le modèle de tumeur MC38 et CT-2A-luc ont été menées chez des souris C57BL/6 femelles âgées de 8 à 12 semaines (Charles River Laboratories). Selon les règlements de l'IACUC, les souris atteintes de tumeurs sous-cutanées ont été euthanasiées sans cruauté une fois que le volume de la tumeur a atteint 2000 mm3. Dans certains cas, cette limite a été dépassée le dernier jour de mesure et les souris ont été immédiatement euthanasiées. À l'exception de ces cas, aucun écart par rapport au protocole approuvé ne s'est produit et le volume maximal de la tumeur n'a pas été dépassé. Tous les animaux ont eu un accès illimité à un régime stérile pour rongeurs en granulés et à de l'eau purifiée par osmose inverse et ont été maintenus sur un cycle lumière: obscurité de 12:12 h avec accès à l'enrichissement environnemental. Tous les protocoles d'animaux pour les souris et les primates non humains ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux d'Oncorus (IACUC) et exécutés conformément aux réglementations de l'IACUC.

Pour établir des modèles de tumeurs de xénogreffe sous-cutanée, 5 × 106–1 × 107 cellules tumorales viables ont été injectées dans le flanc droit de souris nude dans 100 µl de mélange Matrigel (Corning, Glendale, AZ):PBS (Gibco, Gaithersburg) (1:1 v/v). Pour le modèle de tumeur syngénique sous-cutanée N1E-115, 5 × 105 cellules N1E-115 viables ont été injectées dans 100 µl de Matrigel dans un mélange PBS (1: 1 v / v) dans le flanc droit de souris A / J. Le traitement a été initié lorsque les tumeurs ont atteint le volume prédéterminé de 150 ± 30 mm3 pour les modèles de xénogreffe humaine et de 100 ± 25 mm3 pour le modèle de tumeur syngénique. Les animaux ont été appariés en fonction du volume de la tumeur et répartis au hasard dans les bras de traitement. Des virus à ARN synthétique ont été administrés par voie intraveineuse à des doses allant de 0,025 à 3,0 mg/kg à des intervalles hebdomadaires pour un nombre total allant jusqu'à 4 doses, comme expliqué dans les légendes des figures.

L'anticorps anti-PD-1 de souris (clone RMP1-14, n° de cat. BE-0146, BioXCell, Liban, NH) ou le contrôle d'isotype IgG2a de rat (clone 2A3, n° de cat. BE0089, BioXCell, Liban, NH) ont été administrés par voie intrapéritonéale ( IP) à la dose de 200 µg/souris, administré 3 fois tous les 3 jours.

Pour le modèle de tumeur SCLC orthotopique, 5 × 106 cellules NCI-H82 viables en suspension dans un mélange Matrigel: PBS (1: 1 v / v) ont été implantées dans le lobe pulmonaire gauche par injection intra-thoracique. Le traitement a commencé 2 semaines après l'inoculation des cellules orthotopiques et consistait en 2 doses IV de 1,0 mg/kg de Synthetic-SVV-Neg ou Synthetic-SVV administrées à 7 jours d'intervalle. Pour l'analyse de la survie, les souris ont été observées pour des paramètres de survie prédéterminés, qui, dans le cas des tumeurs pulmonaires orthotopiques, comprenaient des symptômes de maladie pulmonaire et une diminution de l'état corporel (c'est-à-dire une perte de poids corporel supérieure à 20 %).

Pour le modèle de tumeur sous-cutanée MC38, 5 × 105 cellules MC38 viables ont été injectées dans 100 µl de PBS dans le flanc droit de souris C57BL/6. Des modèles murins de cancer du sein (4T1) et de carcinome du côlon (CT26) ont été établis chez des souris BALB/c par injection sous-cutanée de 1 × 106 cellules dans 100 µl de PBS dans le flanc droit des animaux. Lorsque les tumeurs ont atteint 250 mm3, les souris ont été euthanasiées sans cruauté, les tumeurs ont été collectées, dissociées par voie enzymatique et immunophénotypées, comme décrit ci-dessous. Pour les tumeurs orthotopiques du gliome de souris CT-2A-luc, des tumeurs ont été établies chez des souris C57BL / 6 femelles âgées de 11 à 12 semaines par injection intracérébrale de 5 × 104 cellules CT-2A-luc en suspension dans 2 µl de PBS. Les tumeurs ont pu se développer pendant 14 jours; ensuite, les souris ont été euthanasiées sans cruauté, les tumeurs ont été collectées, dissociées par voie enzymatique et immunophénotypées, comme décrit ci-dessous.

Des souris nudes avec des tumeurs NCI-H446 sous-cutanées ont été immunisées passivement contre le SVV par injection intrapéritonéale de 1,5 mg d'antisérum SVV de lapin. Les animaux témoins ont reçu une quantité correspondante de sérum de lapin normal (sérum de lapin normal, ImmunoReagents, Inc., Raleigh, NC). Le cycle d'immunisation a été répété deux fois à 7 jours d'intervalle. Après 24 h après chaque transfert de sérum adoptif, les souris témoins et immunisées passivement ont été traitées par voie intraveineuse avec soit 106 PFU de virions SVV, soit 0, 1 mg / kg de SVV synthétique. Selon les règlements de l'IACUC, les souris ont été euthanasiées sans cruauté une fois que le volume de la tumeur a atteint 2000 mm3. Dans certains cas, cette limite a été dépassée le dernier jour de mesure et les souris ont été immédiatement euthanasiées. À l'exception de ces cas, aucun écart par rapport au protocole approuvé ne s'est produit et le volume tumoral maximal n'a pas été dépassé.

Pour établir le modèle SCLC PDX, des fragments de 2 × 2 mm de tumeurs SCLC LU5184 (Crown Bioscience, San Diego) ont été implantés à l'aide d'un trocart stérile dans des souris NOD SCID femelles âgées de 6 à 8 semaines (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME ). Le traitement a commencé une fois que les tumeurs ont atteint un volume prédéterminé d'environ 150 mm3 ± 50 mm3. Les animaux ont été appariés en fonction du volume de la tumeur et répartis au hasard dans les groupes de traitement. Synthetic-SVV et Synthetic-SVV-Neg ont été dosés en 2 doses intraveineuses de 1,0 mg/kg administrées chaque semaine. Les animaux sous traitement ont été observés quotidiennement pour les manifestations cliniques des événements indésirables, le poids corporel et les volumes tumoraux ont été enregistrés toutes les deux semaines. Comme approuvé par l'IACUC de Crown Bioscience, les souris ont été euthanasiées sans cruauté une fois que la charge tumorale a atteint 3000 mm3. Aucun écart par rapport au protocole approuvé ne s'est produit et le volume maximal de la tumeur n'a pas été dépassé.

Pour l'analyse pharmacodynamique de la réplication virale dans les tumeurs SCLC PDX, des souris porteuses de tumeurs ont été traitées avec une dose intraveineuse unique de 1 mg/kg Synthetic-SVV ou Synthetic-SVV-Neg. Cinq jours après le traitement, les tumeurs ont été collectées et traitées pour évaluer l'ARN du SVV à brin négatif par RT-qPCR. Un autre groupe de souris a été traité avec 2 doses intratumorales de 106 PFU SVV-virions les jours 1 et 3. Deux jours après le deuxième traitement, les tumeurs ont été collectées et traitées pour évaluer l'ARN SVV à brin négatif par RT-qPCR.

Le modèle SCLC GEMM a été établi comme décrit précédemment33 au Preclinical Modeling, Imaging & Testing Core (PMIT) de l'Institut Koch. En bref, des souris RPM âgées de 8 semaines (souris Rb1fl/fl Trp53 fl/fl fl/fl Myc LSL/LSL (RPM) contenant un allèle MycT58A régulable par la recombinase Cre sous le contrôle d'un promoteur CAG, The Jackson Laboratory Bar Harbor, ME) ont été anesthésié et infecté avec 106–108 PFU de virus Ad5-Cgrp-Cre (Université de l'Iowa) par instillation intratrachéale comme décrit ailleurs47. Selon les directives du comité de biosécurité institutionnel, les virus ont été administrés dans une salle de niveau de biosécurité 2+. Les souris mâles et femelles ont été également réparties entre les groupes de traitement pour toutes les expériences. Développement de tumeurs orthotopiques SCLC a été surveillé par MicroCT. Les tumeurs ont été collectées et une culture primaire a été établie et maintenue dans un milieu DME (Gibco, Gaithersburg, MD) additionné de 10 % de FBS inactivé par la chaleur (Gibco, Gaithersburg, MD) et de 1 % de pénicilline/streptomycine (Gibco, Gaithersburg, MD) . Pour établir des modèles de tumeurs sous-cutanées, 5 × 106 cellules primaires tumorales viables ont été injectées dans le flanc droit de souris nude dans 100 µl de mélange Matrigel (Corning, Glendale, AZ):DME (Gibco, Gaithersburg) (1:1 v/v) dans le flanc droit des souris RPM. Le traitement a été initié lorsque les tumeurs ont atteint le volume prédéterminé de 100 ± 30 mm3. Synthetic-SVV et Synthetic-SVV-Neg ont été dosés en 2 doses intraveineuses de 1,0 mg/kg administrées chaque semaine. Les animaux sous traitement ont été observés quotidiennement pour les manifestations cliniques des événements indésirables, le poids corporel et les volumes tumoraux ont été enregistrés toutes les deux semaines. Selon les règlements de l'IACUC, les souris ont été euthanasiées sans cruauté une fois que la charge tumorale a atteint 2000 mm3. Aucun écart par rapport au protocole approuvé ne s'est produit et le volume maximal de la tumeur n'a pas été dépassé.

Pour l'analyse pharmacodynamique de la réplication virale dans les tumeurs SCLC GEMM, des souris porteuses de tumeurs ont été traitées avec 2 doses IV de 1 mg/kg de SVV synthétique ou de PBS. Cinq jours après le traitement, les tumeurs ont été collectées et traitées pour évaluer l'ARN SVV à brins négatifs et positifs par RT-qPCR et profilage transcriptionnel à l'aide du panel d'expression génique NanoString Mouse PanCancer IO 360 (données supplémentaires 1, les données brutes sur un échantillon par animal/échantillon et les scores IO360 sont inclus).

La tolérabilité a été évaluée chez des souris A/J permissives au SVV portant des tumeurs N1E-115 sous-cutanées établies comme décrit ci-dessus. Les animaux ont reçu une dose IV de 3 mg/kg de SVV synthétique et ont été observés quotidiennement pour détecter les symptômes cliniques. Les poids corporels ont été recueillis au moins pendant 3 jours consécutifs après chaque traitement. Les réponses immunitaires ont été analysées à 6 et 24 h après le traitement IV, tandis que la pathologie clinique a été évaluée à la fin de l'étude. Pour l'analyse de la biodistribution, les tissus (rate, foie, cœur, poumon, rein, muscle, tumeur) ont été prélevés après 30 min, 24 h et 7 jours et analysés par LC-MS. La réplication virale a été évaluée chez des souris A/J naïves après un seul traitement IV avec 3 mg/kg de SVV synthétique. Les tissus (rate, foie, cœur, poumon, rein) ont été prélevés après 24 h et 7 jours et analysés par dosage de la plaque.

La tolérabilité a été évaluée chez des souris transgéniques huICAM1 CVA21 permissives après une dose IV de Synthetic-CVA21 1,6 mg/kg. Les animaux ont été observés quotidiennement pour les symptômes cliniques des événements indésirables et pesés pendant 5 jours consécutifs après le traitement. La pathologie tissulaire et la réplication de CVA21 chez les animaux traités ont été évaluées 2 et 7 jours après le traitement.

Il est bien établi dans la littérature que la pharmacocinétique de la tolérabilité, la réponse immunitaire, la biodistribution et la tolérabilité diffèrent grandement entre les souris et les NHP en ce qui concerne les nanoparticules lipidiques48. La tolérance au NHP a été évaluée en utilisant des singes cynomolgus mâles naïfs âgés de 3 à 7 ans d'origine mauricienne (Envigo, Indianapolis, IN). Les animaux ont été logés dans un environnement à température et humidité contrôlées (18–30 °C et 30–70 %, respectivement). Le cycle d'obscurité/lumière de 12 h contrôlé automatiquement a été maintenu, sauf aux moments où les procédures programmées ont été effectuées. Tous les animaux ont eu un accès illimité à l'eau, ont été nourris au régime alimentaire NHP 250 et ont eu accès à l'enrichissement de l'environnement, comme indiqué dans les procédures d'exploitation standard.

Le SVV synthétique à une dose de 1 mg/kg a été administré en perfusion IV de 60 min via une veine périphérique (céphalique ou saphène) chez des animaux temporairement restreints non sédatifs. Le traitement a été répété toutes les deux semaines pour un nombre total de 3 doses. Le premier jour de dosage a été désigné comme jour 1. Pour l'analyse PK, des échantillons de sang ont été prélevés à la fin de la perfusion (EOI), 5 min, 0,5, 2, 8, 12, 24 et 48 h. La concentration plasmatique des lipides ionisables (OC) a été déterminée par LC-MS. Une évaluation pharmacocinétique non compartimentale a été réalisée à l'aide du logiciel Phoenix WinNonlin version 8.3 (Certara, Princeton, NJ). Pour l'analyse de pathologie clinique, des échantillons de sang ont été prélevés avant la dose, ainsi que 2, 6 et 24 h après chaque traitement. L'hématologie, la chimie clinique, les cytokines et les taux plasmatiques du composant C5b9 du complément ont été évalués. Des échantillons de tissus (cerveau, mésencéphale, cervelet, bulbe rachidien, moelle épinière, cœur, foie, rein, poumon, rate, ganglion lymphatique mésentérique, muscle squelettique) pour l'analyse de la biodistribution ont été prélevés 24 h après le 3e traitement IV, congelés instantanément et évalué pour la présence d'ARN SVV à brin positif via une analyse RT-qPCR.

La chimie clinique a été analysée à l'aide de l'analyseur Randox Imola (Randox, Kearneysville, WV) ou de l'analyse hématologique effectuée dans l'analyseur automatisé Siemens Advia 120 (Siemens Healthcare GmgH, Erlangen, Allemagne).

L'analyse des taux plasmatiques de cytokines pro-inflammatoires a été réalisée à l'aide de NHP et d'un test multiplex spécifique à la souris (K15056D et K15048D, respectivement; Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD). De plus, la MCP-1 et le TNFα du singe cynomolgus ont été analysés à l'aide de kits de dosage à analyte unique (K156UCK, K156NND, respectivement ; Meso Scale Diagnostics). De même, la MCP-1 de souris a été analysée à l'aide d'un kit de dosage simple plex (K152NN, Meso Scale Diagnostics).

Les niveaux de composants du complément C3 de souris ont été analysés à l'aide du kit ELISA du complément C3 de souris (ab157711, Abcam, Waltham, MA). Les niveaux de C5b9 dans le plasma de singe cynomolgus ont été analysés à l'aide du kit ELISA C5b9 humain (558315, BD, Franklin Lakes, NJ).

Les échantillons ont été maintenus congelés pendant toute la procédure précédant l'extraction de l'ARN en utilisant de la neige carbonique et de l'azote liquide pour la congélation instantanée. Les échantillons ont été pulvérisés à l'aide du pulvérisateur à sec automatisé Cp02 cryoPREP (Covaris, 500001, Covaris, Woburn, MA) pour les échantillons de tumeurs traités par SVV et CVA21. Pour les échantillons de SVV, 10 mg d'échantillon pulvérisé ont été pesés et transférés dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml (Sample Tube RB, QIAGEN 990381, Hilden, Allemagne). Le tampon RLT Plus avec B-mercaptoéthanol (600 µL) a été ajouté à chaque échantillon et lysé. Les étapes restantes ont été effectuées à l'aide du QIAcube (QIAGEN, Hilden, Allemagne), en suivant le protocole du fabricant pour le kit QIAGEN RNeasy Plus Mini (QIAGEN 74134) dans la section Purification de l'ARN total à partir de tissus animaux. Les échantillons d'ARN ont été traités avec DNAseI (sans ARNase) (New England Biolabs, #M0303S, Ipswich, MA) après extraction.

Pour les échantillons CVA21, 10 mg d'échantillon pulvérisé ont été pesés et transférés dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Un mélange de tampon de lyse/protéinase K (400 µL) (Kit de tissu RNAdvance, Beckman Coulter, A32649, Pasadena, CA) a été ajouté à chaque échantillon. Les échantillons ont été incubés à 37 ° C pendant au moins 30 min pour lyser complètement les échantillons. Les étapes restantes ont été réalisées à l'aide du Biomek i5 (Beckman Coulter, B87583, Pasadena, CA) en suivant le protocole du fabricant (RNAdvance Tissue Kit). Le kit de tissus RNAdvance comprend une étape de traitement à la DNase I.

Les échantillons d'ARN ont été normalisés à une entrée égale pour la synthèse d'ADNc. Des amorces spécifiques du brin négatif du virus ont été utilisées pour synthétiser l'ADNc. L'amorce spécifique du brin négatif du SVV 5′-GCGCAAATTCGTCCAAAACAACGAC-3′, l'amorce spécifique du brin positif du SVV 5′ ACATAGAAACAGATTGCAGCTTCTC -3′ et l'amorce spécifique du brin négatif du CVA21 5′-AGACTACGGACTGACCATGACTC TTAGGACGCTTTTACTGAGAAC -3′ ont été synthétisées par Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, Iowa). Pour le SVV et le CVA21, la synthèse d'ADNc a été réalisée à l'aide du système de synthèse du premier brin SuperScript IV (Invitrogen, 18091200, Carlsbad, CA) et de leurs amorces spécifiques respectives.

L'analyse PCR quantitative (qPCR) a été réalisée à l'aide de la chimie de la sonde TaqMan. Des réactions qPCR (20 µL) contenant 10 µL de TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, 4444557, Foster City, CA), 1 µL de TaqMan Gene Expression Assay, sonde FAM (Applied Biosystems, 4332078), 4 µL de nucléase -eau libre et 5 µL d'ADNc dilué. Les sondes TaqMan Gene Expression Assay ont été personnalisées pour le SVV ou le CVA21. Sonde SVV 5′-TGGAAGCCATGCTCTCCTACTTCA-3′, amorce sens 5′-CGACGGCTTATACAAACCAGTTA-3′, amorce antisens 5′-AGCTTCTCGAGTAGTGTTCCT-3′ et sonde CVA21 5′-TGCCTATGGTGATGACGTGATAGCT-3′, amorce sens 5′- GAGAACC TACAAGGGGCATAGAC-3′, et l'amorce inverse 5′-TAGGAGACTAGCGTCAACCT-3′ ont été commandées sur mesure auprès d'Applied Biosystems (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Paramètres qPCR 95 ° C pendant 20 s suivi de 40 cycles à 95 ° C pendant 1 s et 60 ° C pendant 30 s. Chaque test qPCR contenait des triplicats techniques pour chaque standard et échantillon.

Les tumeurs ont été récoltées aux moments indiqués, coupées en deux, fixées dans du formol tamponné à 10 % pendant 24 h à température ambiante et incluses dans de la paraffine. RNAscope FISH des brins d'ARN négatifs et positifs du SVV a été réalisé chez Advanced Cell Diagnostics (ACD, Newark, CA). Des conditions de prétraitement fluorescentes standard RNAscope LS Multiplex ont été utilisées. En bref, la récupération d'épitope a été effectuée à 15 min à 95 ° C, suivie d'un traitement à la protéase III pendant 15 min à 40 ° C. La qualité des échantillons a d'abord été évaluée à l'aide des contrôles de référence positifs et négatifs pour la spécificité et la sensibilité (numéros de catalogue ACD 313908 et 320758, respectivement). Des sondes SVV personnalisées ont été conçues pour les brins positifs et négatifs (numéros de catalogue ACD 819848 et 819858-C2, respectivement) et ont été confirmées comme étant spécifiques. Tous les échantillons ont passé le CQ avec une coloration de contrôle positif, et peu ou pas de coloration de fond a été observée. Les données RAW ont été analysées avec le logiciel 3DHISTECH CaseViewer (3DHISTECH Ltd, Budapest, Hongrie).

La concentration en lipides OC a été déterminée par analyse LC-MS. Une solution mère standard à 100 ng/ml a été préparée dans de l'acide formique à 1 % dans du méthanol. Pour l'analyse des échantillons de plasma, le stock standard a été dilué dans du plasma à 200, 180, 120, 40, 20, 5, 1 et 0,5 μg/ml, tandis que pour l'analyse des tissus, une courbe standard a été générée à 80, 72, 48, 16, 8, 2, 0,4 et 0,2 mg/ml dans un homogénat de tissu. Cinq µl d'échantillon de plasma ont été mélangés avec 120 µl de contrôle standard interne (IS-C), vortexés pendant 3 min et centrifugés à 12 500 RPM à 5 °C pendant 4 min. Soixante ul de surnageant résultant ont été mélangés avec 140 ul de solution eau:acétonitrile (3:7 v/v) et secoués pendant 5 min. Une aliquote de 0,6 µl de surnageant résultant a été injectée pour analyse LC-MS.

Vingt-cinq µl d'homogénats de tissus obtenus à partir d'échantillons de tissus homogénéisés dans de l'eau à un rapport de 1:1 mμm ont été mélangés avec IS-C, vortexés pendant 3 min, puis mélangés avec 140 µl d'eau et une solution d'acétonitrile (3:7 v/v) , et secoué pendant 5 min. Une aliquote de 0,6 µl de surnageant résultant a été injectée pour analyse LC-MS.

Un système Waters Zevo TQs équipé d'un détecteur MRM a été utilisé pour la séparation chromatographique. La séparation a été réalisée sur une colonne XB-C8 (50 mm x 2,1 mm, 3,6 µm) avec un volume d'injection de 0,6 µl. Les phases mobiles consistaient en 0,1 % d'acide formique dans l'eau (A) et 0,1 % d'acide formique dans l'acétonitrile : alcool isopropylique (66:34 v/v) (B). Les échantillons ont été analysés en utilisant un débit de 0,5 ml/min et le programme de gradient suivant : 54–100 % B (0–1,51 min), 100 % B (1,51–1,8 min), 100–54 % B (1,80–1,81 min ), et 54 % B (1,81–2,8 min). L'ionisation a été réalisée en utilisant l'ionisation par électrospray (ESI) en mode positif avec détection MRM.

Les poumons ont été prélevés sur les animaux traités 10 jours après la deuxième dose de Synthetic-SVV et ont été fixés dans du formol tamponné à 10 % pendant 24 h, traités à la paraffine et sectionnés au niveau des bronches principales. Pour la détection IHC de DLL3, les sections ont été colorées avec un anticorps de lapin spécifique à la DLL3 humaine (0, 5 μg / ml, Clone E3J5R, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), numérisées et soumises à une analyse morphométrique à l'aide du logiciel QuPath.

Les tumeurs surgelées (n = 5 souris par groupe de traitement) ont été pulvérisées et l'ARN a été extrait à l'aide de QIAcube (QIAGEN, Hilden, Allemagne), en suivant le protocole du fabricant pour le kit QIAGEN RNeasy Plus Mini (QIAGEN 74134) dans la section Purification de ARN total de tissus animaux. L'ARN total isolé (60 ng) a été mélangé dans un volume final de 25 µl avec une sonde de capture biotinylée en 3 'et des sondes rapporteuses en 5' du panel d'expression génique Mouse PanCancer IO 360. L'hybridation a été réalisée à 65 °C pendant 16 h. Les échantillons hybrides ont été isolés sur la station de préparation NanoString nCounter où la sonde en excès a été retirée, et les complexes hybrides de sondes et de séquences d'ARN cibles ont été immobilisés sur la cartouche. Les échantillons liés à la cartouche ont ensuite été analysés à l'aide de l'analyseur numérique nCounter. La collecte de données a été effectuée sur l'analyseur numérique nCounter (NanoString Technologies) en suivant les instructions du fabricant pour compter les codes-barres fluorescents individuels et quantifier les molécules d'ARN cibles présentes dans chaque échantillon. Pour chaque test, un balayage haute densité (600 champs de vision) a été réalisé. Analyse de l'expression génique Nanostring nCounter™ Le nombre relatif de copies d'ARNm sur 770 gènes liés au cancer et au système immunitaire a été quantifié sur le système NanoString nCounter™ (NanoString Technologies), conformément aux instructions du fabricant. Les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel d'analyse nSolver 4.0 (NanoString). Lors de la soustraction de fond (suppression de la moyenne géométrique des témoins négatifs), chaque échantillon a d'abord été normalisé à la moyenne géométrique des témoins positifs, puis à la moyenne géométrique des gènes de référence.

Pour la cytométrie en flux, les tumeurs ont été prélevées au jour 14 après la première dose. Les tumeurs ont été pesées puis coupées en petits morceaux avant d'être désagrégées en suspensions unicellulaires à l'aide d'un octo-dissociateur Miltenyi GentleMACs avec des éléments chauffants conformément aux instructions du fabricant. Des cellules AT/NK et un panel de flux de cellules myéloïdes ont été réalisés à l'aide des réactifs et des clones Ab suivants : Un kit de coloration des cellules mortes rouges fixables LIVE/DEAD™ pour une excitation à 488 nm (Invitrogen, Catalog # L32102) a été utilisé pour évaluer la viabilité. La coloration des cellules de surface a été réalisée à l'aide du BD Stain Buffer (Becton-Dickinson Catalog # 554656) avec les anticorps pour souris CD45 (30-F11, Catalog # 103154), CD3ε (17A2, Catalog # 100218), CD8a (53-6.7, Catalog # 100730), CD4 (RM4-5, catalogue # 100552), CD25 (PC61, catalogue # 102041) CD69 (REA937, catalogue # 130-115-461), CTLA-4 (UC10-4B9, catalogue # 106323), NKP46 (29A1.4, catalogue n° 137612), KLRG1 (2F1, catalogue n° 138409), CD127 (A7R34, catalogue n° 135035), PD-1 (29F.1A12, catalogue n° 135216), MHCII (M5/114.15.2, catalogue # 107635), Ly6C (H, 1.4, catalogue # 128037), CD206 (C068C2, catalogue # 141720), CD86 (GL-1, catalogue # 105037) et PD-L1 (10F.9G2, catalogue # 124312). Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience Catalogue # 00-5523-00) a été utilisé pour la coloration intracellulaire FOXP3 (150D, Catalogue # 320008) et CTLA-4 (UC10-4B9, Catalogue # 106323). Tous les anticorps ont été achetés auprès de BioLegend (San Diego, États-Unis), à l'exception de CD69 Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Allemagne). Les dilutions d'anticorps étaient les suivantes : CD45-APC-Fire750 (1 : 400), CD3-PerCP-Cy5.5 (1 : 100), NKp46-BV421 (1 : 200), CD4-BV785 (1 : 800), CD8- AF700 (1:400), CD25-BV711 (1:200), Foxp3-PE (1:200), CTLA4-BV605 (1:200), PD1-PE-Cy7 (1:200), CD127-BV510 (1 :100), KLRG1-FITC (1:400), CD11b-BV650 (1:400), MHCII-BV510 (1:200), Ly6C-BV711 (1:200), CD206, PE-Cy7 (1:100) , CD86-BV605 (1:100) et PDL1-APC (1:100). Les données ont été acquises sur un BD LSRFortessa à l'aide du logiciel BD FACSDiva et analysées à l'aide du logiciel FlowJo. Pour le panel de cellules T et NK, les cellules ont d'abord été contrôlées pour le temps (SSC-A vs Time), les lymphocytes (SSC-A vs FSC-A) et les singlets (FSC-H vs FSC-A). La porte des lymphocytes a été analysée plus avant pour leur absorption de la coloration Live/Dead afin de déterminer les cellules vivantes par rapport aux cellules mortes et l'expression de CD45. Ensuite, les cellules ont été contrôlées sur CD3 contre NKP46 pour sélectionner les cellules T ou les cellules NK. Pour les lymphocytes T, la population a été contrôlée pour CD4 contre CD8, et les cellules T CD4 ont été davantage contrôlées pour CD25 + et FOXP3 + afin d'analyser la population Treg. Les cellules NK ont été fermées pour NKP46 + et CD3-. Pour le panel myéloïde, les cellules ont d'abord été contrôlées dans le temps (SSC-A vs Time) puis les lymphocytes (SSC-A vs FSC-A) et les singlets (FSC-H vs FSCA). La porte des lymphocytes a été analysée plus avant pour leur absorption de la coloration Live/Dead afin de déterminer les cellules vivantes par rapport aux cellules mortes et l'expression de CD45. Ensuite, les macrophages ont été contrôlés en utilisant SSC-A contre CD11b + et ensuite sur le sous-ensemble MHCII + Ly6C. Pour distinguer les macrophages M1 et M2, nous avons utilisé CD206-CD86+ pour M1 et CD206+CD86- pour M2. Le dénombrement des cellules par mg de tumeur a été calculé à l'aide de 123Count eBeads (Invitrogen, catalogue # 01-1234-42, Carlsbad, CA). Un volume fixe de billes avec une concentration connue a été ajouté à chaque puits avant l'analyse par cytométrie en flux. Le nombre de perles dans la fraction fermée a ensuite été utilisé pour calculer le nombre de cellules en utilisant l'équation suivante :

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article, les informations supplémentaires ou le fichier de données source. Les données sources sont fournies avec ce document.

Andtbacka, RH et al. Talimogene laherparepvec améliore le taux de réponse durable chez les patients atteints de mélanome avancé. J.Clin. Oncol. 33, 2780-2788 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Andtbacka, RHI et al. Données finales de CALM : Une étude de phase II sur l'immunothérapie par le virus oncolytique du virus Coxsackie A21 (CVA21) chez des patients atteints de mélanome avancé. J.Clin. Oncol. 33, 9030–9030 (2015).

Article Google Scholar

Zheng, M., Huang, J., Tong, A. & Yang, H. Virus oncolytiques pour le traitement du cancer : Obstacles et avancées récentes. Mol. Là. Oncolytiques 15, 234–247 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Martinez-Quintanilla, J., Seah, I., Chua, M. & Shah, K. Virus oncolytiques : surmonter les défis de traduction. J.Clin. Investir. 129, 1407-1418 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamamoto, Y., Nagasato, M., Yoshida, T. & Aoki, K. Progrès récents dans la modification génétique des vecteurs adénoviraux pour le traitement du cancer. Cancer Sci. 108, 831–837 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Menotti, L. et al. HSV en tant que plate-forme pour la génération de virus oncolytiques reciblés, armés et exprimant des rapporteurs. Virus https://doi.org/10.3390/v10070352 (2018).

Franco-Luzon, L. et al. L'adénovirus oncolytique systémique délivré dans les cellules porteuses mésenchymateuses module les cellules immunitaires infiltrant la tumeur et le microenvironnement tumoral chez les souris atteintes de neuroblastome. Oncocible 11, 347–361 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Berkeley, RA et al. Le réovirus neutralisé par anticorps est efficace en virothérapie oncolytique. Cancer Immunol. Rés. 6, 1161-1173 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Choi, JW, Lee, YS, Yun, CO & Kim, SW Adénovirus oncolytique polymérique pour la thérapie génique du cancer. J. Control Release 219, 181–191 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brugada-Vila, P. et al. AdNuPARmE1A enrobé de poly(bêta-aminoester) modifié par oligopeptide : Renforcement de l'efficacité des adénovirus thérapeutiques administrés par voie intraveineuse. Théranostic 10, 2744–2758 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tesfay, MZ et al. La PEGylation du virus de la stomatite vésiculeuse prolonge la persistance du virus dans la circulation sanguine des souris immunisées passivement. J. Virol. 87, 3752–3759 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. Encapsulation dans les liposomes du virus oncolytique M1 pour réduire l'immunogénicité et la clairance immunitaire in vivo. Mol. Pharm. 16, 779–785 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Aoyama, K. et al. ADN plasmidique encapsulé dans des liposomes d'un adénovirus oncolytique spécifique de la télomérase avec un effet furtif sur le système immunitaire. Sci. Rep. 7, 14177 (2017).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roberts, TC, Langer, R. & Wood, MJA Progrès dans l'administration de médicaments oligonucléotidiques. Nat. Rev. Drug Discov. 19, 673–694 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weng, Y. et al. Amélioration de la thérapie par les acides nucléiques grâce à la biotechnologie avancée à l'échelle nanométrique. Mol. Là. Acides nucléiques 19, 581–601 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Burke, MJ Virus oncolytique de la vallée de Seneca : perspectives passées et orientations futures. Virother oncolytique. 5, 81–89 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schenk, EL et al. Une étude de phase II randomisée en double aveugle du virus de la vallée de Seneca (NTX-010) versus placebo chez des patients atteints d'un SCLC au stade étendu (ES SCLC) qui étaient stables ou répondaient après au moins quatre cycles de chimiothérapie à base de platine : cancer du centre-nord groupe de traitement (Alliance) étude N0923. J. Thorac. Oncol. 15, 110-119 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hamid, O., Ismail, R. & Puzanov, I. Mise à jour de l'immunothérapie intratumorale 2019. Oncologue 25, e423–e438 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Annels, NE et al. Essai de phase I d'un coxsackievirus immunothérapeutique A21 (CVA21) ciblant ICAM-1 en tant qu'agent oncolytique contre le cancer de la vessie non invasif sur le plan musculaire. Clin. Cancer Rés. 25, 5818–5831 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Xu, W. et al. Analyse à l'échelle du génome de l'évolution du sénécavirus A à partir de matériel clinique porcin et d'échantillons environnementaux de parcs de rassemblement. PLoS One 12, e0176964 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Cao, L. et al. Fixation et décapage du virus Seneca Valley par l'intermédiaire de son récepteur récepteur de la toxine de l'anthrax 1. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 115, 13087–13092 (2018).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reddy, PS et al. Seneca Valley virus, un picornavirus oncolytique distribuable par voie systémique, et le traitement des cancers neuroendocriniens. J. Natl Cancer Inst. 99, 1623–1633 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pandaha, H. et al. Résumé CT115 : Phase 1bKEYNOTE 200 (étude STORM) : Étude d'un virus oncolytique administré par voie intraveineuse, le Coxsackievirus A21 en association avec le pembrolizumab chez des patients atteints d'un cancer avancé. Cancer Rés. 77, CT115–CT115 (2017).

Article Google Scholar

McCarthy, C., Jayawardena, N., Burga, LN et Bostina, M. Développer des picornavirus pour le traitement du cancer. Cancers https://doi.org/10.3390/cancers11050685 (2019).

Burroughs, KD et al. Caractérisation in vivo du Seneca Valley Virus (SVV-001), un nouveau picornavirus oncolytique pour le traitement systémique des patients atteints de tumeurs solides à caractéristiques neuroendocrines. Thérapie génique ciblée sur le cancer : études cliniques et précliniques 17, 888–895 (2006).

Google Scholar

Abrams, MT et al. Évaluation de l'efficacité, de la biodistribution et de l'inflammation d'une puissante nanoparticule d'ARNsi : effet du co-traitement à la dexaméthasone. Mol. Là. 18, 171–180 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dufresne, AT & Gromeier, M. Un entérovirus non polio à tropisme respiratoire provoque la poliomyélite chez les souris transgéniques de la molécule d'adhésion intercellulaire 1. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 101, 13636–13641 (2004).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hadac, EM & Russell, SJ 436. Le virus coxsackie A21 a une activité oncolytique puissante dans le myélome multiple. Mol. Là. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2006.08.502 (2006).

Izumchenko, E. et al. Les xénogreffes dérivées de patients capturent efficacement les réponses au traitement oncologique dans une cohorte hétérogène de patients atteints de tumeurs solides. Ann. Oncol. 28, 2595-2605 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drapkin, BJ et al. Fidélité génomique et fonctionnelle des xénogreffes dérivées de patients atteints de cancer du poumon à petites cellules. Découverte du cancer. 8, 600–615 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

George, J. et al. Profils génomiques complets du cancer du poumon à petites cellules. Nature 524, 47 (2015).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stewart, CA et al. Les analyses unicellulaires révèlent une hétérogénéité intratumorale accrue après le début de la résistance au traitement dans le cancer du poumon à petites cellules. Nat. Cancer 1, 423–436 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mollaoglu, G. et al. MYC entraîne la progression du cancer du poumon à petites cellules vers un sous-type neuroendocrine variant avec une vulnérabilité à l'inhibition de la kinase aurora. Cellule cancéreuse 31, 270-285 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ottonello, S. et al. Association entre la réponse au traitement par nivolumab et les sous-ensembles de lymphocytes du sang périphérique chez les patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules. Devant. Immunol. 11, 125 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gollamudi, R. et al. L'administration intraveineuse de Reolysin, un virus à ARN vivant compétent pour la réplication, est sans danger chez les patients atteints de tumeurs solides avancées. Invest N. Drugs 28, 641–649 (2010).

Article Google Scholar

Machiels, JP et al. Une étude de phase 1 d'escalade de dose de l'adénovirus oncolytique enadenotucirev, administré par voie intraveineuse à des patients atteints de tumeurs solides épithéliales (EVOLVE). J. Immunother. Cancer 7, 20 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Haines, BB et al. ONCR-177, un HSV-1 oncolytique conçu pour activer puissamment l'immunité antitumorale systémique. Cancer Immunol. Rés. 9, 291–308 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zhu, PP, Yuan, SG, Liao, Y., Qin, LL et Liao, WJ Un niveau élevé de molécule d'adhésion intercellulaire-1 affecte le pronostic des patients atteints de carcinome hépatocellulaire. Monde J. Gastroenterol. 21, 7254–7263 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Staal-van den Brekel, AJ, Thunnissen, FB, Buurman, WA & Wouters, EF Expression de la sélectine E, de la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM) -1 et de la molécule d'adhésion cellulaire vasculaire (VCAM) -1 dans le poumon non à petites cellules carcinome. Arc de Virchow. 428, 21-27 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kose, N. et al. Un ARNm encapsulé dans des lipides codant pour un anticorps monoclonal humain puissamment neutralisant protège contre l'infection par le chikungunya. Sci. Immunol. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.aaw6647 (2019).

Août, A. et al. Un essai de phase 1 d'ARNm encapsulé dans des lipides codant pour un anticorps monoclonal à activité neutralisante contre le virus Chikungunya. Nat. Méd. https://doi.org/10.1038/s41591-021-01573-6 (2021).

Lemos de Matos, A., Franco, LS & McFadden, G. Virus oncolytiques et système immunitaire : le duo dynamique. Mol. Là. Méthodes Clin. Dév. 17, 349-358 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rudin, CM, Brambilla, E., Faivre-Finn, C. & Sage, J. Cancer du poumon à petites cellules. Nat. tour. Dis. Prime. 7, 3 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Samstein, RM et al. La charge mutationnelle tumorale prédit la survie après immunothérapie dans plusieurs types de cancer. Nat. Genet. https://doi.org/10.1038/s41588-018-0312-8 (2019).

Hales, LM et al. Analyse complète de la séquence du génome du Seneca Valley virus-001, un nouveau picornavirus oncolytique. J. Gen. Virol. 89, 1265-1275 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Newcombe, NG et al. Les interactions de la capside de l'entérovirus avec le facteur d'accélération de la décomposition médient l'infection des cellules lytiques. J. Virol. 78, 1431–1439 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jackson, EL et al. Analyse de l'initiation et de la progression de la tumeur pulmonaire à l'aide de l'expression conditionnelle de K-ras oncogène. Gènes Dév. 15, 3243-3248 (2001).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marlowe, JL et al. Recommandations du sous-comité des oligonucléotides formulés du groupe de travail sur la sécurité des oligonucléotides pour l'évaluation de la sécurité des thérapeutiques à base d'oligonucléotides formulés. Nucleic Acid Ther. 27, 183-196 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

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Cette étude a été parrainée par Oncorus, Inc. Les auteurs reconnaissent et remercient Sofie Denies pour l'analyse statistique, James B. Rottman (Athenaeum Pathology Consulting) pour l'analyse morphométrique. Les auteurs remercient également Chastity Bradley, PhD de BioMed Writers, LLC, pour sa révision éditoriale et son aide à la soumission du manuscrit.

Oncorus, Inc., Cambridge, MA, États-Unis

Edward M. Kennedy, Agnieszka Denslow, Jacqueline Hewett, Lingxin Kong, Ana De Almeida, Jeffrey D. Bryant, Jennifer S. Lee, Judy Jacques, Sonia Feau, Melissa Hayes, Elizabeth L. McMichael, Daniel Wambua, Terry Farkaly, Amal A Rahmeh, Lauren Herschelman, Danielle Douglas, Jacob Spinale, Sanmit Adhikari, Jessica Deterling, Matt Scott, Brian B. Haines, Mitchell H. Finer, Ted T Ashburn, Christophe Quéva et Lorena Lerner

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Conceptualisation : EMK, MF, CQ et LL Méthodologie : EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DW, TF, AAR, LH, DD, JS, SA, JD, Logiciel MS, BBH, CQ et LL : EMK, AD, JSL, SF et DW Validation : EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DWTF, AAR, LH, DD, JS, SA, JD et MS Analyse formelle : EMK, AD, JDB, JSL, JJ, SF, BBH, CQ, LL Rédaction – révision et révision : EMK, AD, ADA, JDB, JSL, SF, JD, MS, BBH, CQ et LL Supervision : EMK, AD, SF, BBH, CQ et LL Administration du projet : EMK, CQ et LL Approbation de la version finale : EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DWTF, AAR, LF, DD, JS, SA, JD, MS, BBH, TTA, MF, CQ et LL

Correspondance à Edward M. Kennedy.

EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB et JSL (au moment où l'étude a été menée), JJ, SF (au moment où l'étude a été menée), MH, ELM, DW, TF, AAR (au moment l'étude a été réalisée), LH (au moment de la réalisation de l'étude), DD (au moment de la réalisation de l'étude), JS (au moment de la réalisation de l'étude), SA (au moment de la réalisation de l'étude), JD, MS (au moment de la réalisation de l'étude), BBH (au moment de la réalisation de l'étude), MF (au moment de la réalisation de l'étude), TTA, CQ, LL (au moment de la réalisation de l'étude) sont tous les employés d'Oncorus, Inc. Aucun autre auteur n'a d'intérêts concurrents à divulguer.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Kennedy, EM, Denslow, A., Hewett, J. et al. Développement d'une immunothérapie par virus à ARN synthétique administrée par voie intraveineuse pour le traitement du cancer. Nat Commun 13, 5907 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33599-w

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Reçu : 11 mars 2022

Accepté : 24 septembre 2022

Publié: 07 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-33599-w

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